Подсчет одиночных клеток с помощью проточной цитометрии

Многие инструменты предоставляют полезную информацию о биологических системах, которой располагают биологи. Одним из особенно полезных методов, который помог во многих областях, является проточная цитометрия. В этой статье будет представлен краткий обзор метода и того, как он используется для подсчета отдельных клеток в популяции.

Что такое проточная цитометрия?

Проточная цитометрия – это надежный аналитический инструмент, используемый для подсчета клеток в растворе. Он обеспечивает многопараметрический анализ отдельных клеток (или частиц) по мере их прохождения мимо лазера, создавая как рассеянные, так и флуоресцентные световые сигналы, которые затем анализируются сложным программным обеспечением. Характеристики этих сигналов используются для определения физических и химических характеристик клеток и частиц, а также для получения количественных данных. Проточная цитометрия – это высокопроизводительный метод.

Проточный цитометр обычно состоит из инжектора и пробирки для образцов, лазера (это может быть один или несколько лазеров), оптического детектора и программного обеспечения, необходимого для анализа полученных данных. В идеале образец фокусируется так, чтобы клетки проходили через лазер по одной за раз. В клетки вводятся флуоресцентные маркеры, которые создают уникальные спектры, дающие характеристическую информацию о клеточных процессах.

Рассеивание видимого света, создаваемое лазером, дает информацию об относительном размере клетки (прямое рассеяние) и внутренней сложности клетки (боковое рассеяние). Это рассеяние света не зависит от флуоресценции. Образцы готовят для флуоресцентного анализа путем окрашивания флуоресцентными красителями или флуоресцентно конъюгированными антителами. Также можно использовать квантовые точки.

Проточная цитометрия нашла применение в таких областях, как иммунология, молекулярная биология, вирусология и мониторинг инфекционных заболеваний. Помимо анализа клеточных популяций, проточная цитометрия используется для сортировки клеток для дальнейшего анализа. Это чрезвычайно важная технология, которая стала одним из эталонов аналитической биологии.

Использование проточного цитометра

Проточная цитометрия использовалась в клинических испытаниях, клинической практике и различных исследованиях. Использование включает:

• Обнаружение биомаркеров;
• Сортировка клеток;
• Подсчет клеток;
• Обнаружение белковой инженерии;
• Диагностика заболеваний;
• Определение функций и характеристик клеток;
• Обнаружение микроорганизмов.

Подсчет отдельных клеток с помощью проточной цитометрии

Как уже упоминалось, проточная цитометрия используется для определения клеток в популяции. Однако простого пропускания клеток (или частиц) через проточный цитометр недостаточно для сортировки и анализа отдельных клеток. Клетки должны равномерно проходить лазер, чтобы точно измерить их свойства.

Одна из основных проблем при достижении этого заключается в том, что проточная ячейка должна быть достаточно тонкой, чтобы вместить одну клетку. Обычных производственных процессов недостаточно для создания проточной ячейки такого размера, так как ее ширина должна составлять всего несколько микрометров, а длина – несколько миллиметров. Большинство стандартных проточных ячеек имеют размер 250 х 250 микрометров, что недостаточно.

Для решения этой проблемы была проделана большая работа и разработаны новые методы, позволяющие лучше сфокусировать образец в проточной ячейке, чтобы сделать возможным анализ одной клетки. Они включают:

• Гидродинамическое фокусирование – этот широко используемый метод использует принципы гидродинамики для сортировки клеточных популяций на отдельные клетки для анализа с помощью проточного цитометра. В широких проточных ячейках создается оболочка из жидкости, и образец вводится в центр. Если две жидкости достаточно различаются по плотности или скорости, достигается стабильный двухслойный поток.
• Гидродинамическая фокусировка с акустической поддержкой – отличается от гидродинамической фокусировки, поскольку в ней используется радиационное давление. Этот метод обеспечивает гораздо более высокие объемные скорости ввода, чем достижимые только с помощью гидродинамической фокусировки. Сокращается время анализа, а также изменяются или исключаются этапы сгущения при подготовке образца. Объемы субмикролитра также могут быть обработаны с использованием разбавления образца.
• Магнитная проточная цитометрия – образцы клеток также могут быть отсортированы с помощью магнитной фокусировки. С помощью этого метода можно сортировать и анализировать маркированные клетки даже в относительно непрозрачных средах, таких как цельная кровь. Этот новый метод демонстрирует потенциал для магнитного зондирования клеток по времени пролета в различных клинических условиях, даже у постели больного. Исследования этого нового цитометрического метода продолжаются.
• Флуоресцентная проточная цитометрия – использует луч полупроводникового лазера для разделения флуоресцентно маркированных клеток. Используются три разных сигнала: прямое рассеяние, боковое рассеяние и боковой флуоресцентный свет. Переднее рассеяние дает информацию о размере клеток, боковое – о содержимом и структуре клеток, а боковая флуоресценция дает информацию о присутствующих нуклеиновых кислотах. Этот метод используется для подсчета бактерий, эритроцитов и лейкоцитов, а также других элементов. Флуоресцентная проточная цитометрия используется в анализаторах для таких исследований, как анализ мочи и гематология.

В заключении

Проточная цитометрия – это невероятно надежный высокопроизводительный аналитический метод. В последние годы эта методика была адаптирована к потребностям современной медицины, предоставляя высокоточную информацию о физических и химических характеристиках отдельных клеток в популяции. Новые методы появляются постоянно, и исследования в этой области представляют собой одни из самых новаторских взглядов в современной медицинской науке.